Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

(Vermehrung durch Pflanzenteile, zB. Stecklinge, Teilung, Abmoosen, etc.)

Moderator: Svenson

Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 20. Sep 2011, 01:32

:greensmilies142: In-Vitro-Vermehrung bedeutet die Vermehrung im Glas. :greensmilies141:

...kurze Begrifferklärung zu;

1. Meristem...
... dies ist der höchste Wuchspunkt der Pflanze, diese Wuchspunkte sitzen in sogenannten Augen oder an der Triebspitze. Ebenso in den Wurzelspitzen.
Hierbei handelt es sich um Zellgewebe aus dem sich entweder neue Triebe und Blätter entwickeln oder eben die Wurzeln sprießen.

2. Gewebekultur...

... dies ist ein Überbegriff, denn hier passt auch das Meristem mit hinein, allerdings dient der Überbegriff eben auch für Pflanzenexplantate.
Dies können eben die Meristeme sein oder Wurzelstücke, Triebstücke, Blätter, Blüten, Pollen, eben alles von der Pflanze, sogar einfach nur einzelne Zellen.

Nun gibt es zudem noch innerhalb dieser Vermehrungsmethode weitere Unterteilungen, dies würde jetzt aber zu kompliziert.

Die hierdurch vermehrten Pflanzen sind somit Klone, genau wie durch Teilung, Stecklingsvermehrung, etc. vegetativ vermehrten Pflanzen.
Allerdings ermöglicht die In-Vitro-Vermehrung eine rasche Reproduktion (Vervielfältigung) von Pflanzen in kurzer Zeit.
Dies findet Gebrauch zum schnellen Aufbau von Mutterpflanzen und zur schnellen Anzucht neuer Sorten für die Vermarktung im großen Stil, ebenso in der Arterhaltung seltener Pflanzen oder ähnlichem Bezug.

Um nun Pflanzen im Labor regenerieren zu können ist es nun wichtig das passende Nährmedium zusammenzustellen. Je nach Pflanze gibt es hier verschiedene Ansprüche an Micro und Makro Elementen und verschiedensten Phytohormonen.

Hat man die passende Zusammensetzung des Mediums, kann dann begonnen werden.

Wichtig ist nun das sterile Arbeiten!!!

Dies geschieht in einer sogenannten Sterilbank, welche mit einem Steril-Luft-Filter ausgestattet ist und genügend Platz zum Arbeiten ermöglicht.
Zudem müssen sämtliche Arbeitsgeräte steril sein, ebenso die Kulturgläser welche den Pflanzen als Wohnraum dienen.

Kulturgläser und Geräte werden zum Beispiel mit Autoklaven sterilisiert und die Geräte zudem in der sterilen Werkbank nochmals mit Desinfektionsmittel gereinigt, ebenso nach jedem Arbeitsgang an einem Bunsenbrenner abgeflammt.

Wieso steril?

Dies ist die Grundlage dieser vermehrungsmethode, denn sonst würden sämtliche Keime in die Kulturen gelangen und sich auf dem synthetischen Nährmedium sehr schnell ausbreiten und die eigentliche Kultur zerstören.

Zum Meristem;

Dieses wird, wenn es sehr winzig ist, unter dem Mikroskop aus den feinen Schutzblättchen herausgeschnitten und in eine Desinfektionslösung gegeben um diese keimfrei zu bekommen.

Nun hat dieses Explantat Wundstellen dies ist auch wichtig zur Kultur.

Das Explantat kommt nun in ein flüssiges Nährmedium, welches mit Cytokeninen angereichert wurde. Cytokenine sind Phytohormone, welche das allgemeine Zellwachstum beeinflussen und anregen.

Das Behältnis wird nun steril verschlossen und kommt auf ein Rotationsrad oder Schüttelgerät. Durch die schwenkenden, kreisenden oder schüttelnden Bewegungen regt man das Gewebe dann an Zellen zu entwickeln, darum sind die Wundstellen wichtig, da sich hier neues Zellgewebe bildet. Da dieses durch diese Rotationen nicht wissen wo oben und unten ist, ebenso aufgrund der Cytokenine, entwickeln sich nur neutrale Zellen in Form eines Klumpen. Der sogenannte Kallus, dies ist zudem das normale Stadium auch bei allen Pflanzen, aus denen sich dann die Wurzeln, in der Vermehrung, bilden.
Dieser kallusklumpen sieht aus wie ein kleines blumenkohlähnliches Gebilde.

Dieser Kallusklumpen wird dann wieder steril in der Werkbank, wie zuvor auch beschrieben, bearbeitet.
Man kann nun Stückchen davon abtrennen, welche alle so weiterwachsen würden, wenn man sie in weitere flüssigen Nährmedien legen würde, so kann man Unmengen von Zellstämmen anlegen.

Jedoch kann man diese Stückchen jetzt auch auf festen Nährmedien umbetten, hier fällt die Rotation nun weg und es entwickeln sich jetzt kleine Blättchen und folgende Triebe. Jedoch noch keine Wurzeln.

Die hier wachsenden Pflänzchen können ebenfalls wieder in der Werkbank voneinander abgetrennt werden und haben wiederum Wundstellen, an denen sich überall wieder auf festen Nährboden neue Triebe entstehen und so kann man quasi unendlich viele neue Pflanzen regenerieren.

Da jedoch noch keine Wurzeln vorhanden sind wird dies nun erzielt, indem mal den festen Nährmedien Auxine beimengt. Dies sind ebenfalls Phytohormone, welche jedoch speziell das Wurzelwachstum beinflussen und anregen.

So können nun im Glas vollständige Minipflanzen entstehen.

Dieser Vorgang wird auch genauso bei der 2. Variante vollzogen, bei der Gewebekultur.

Zu unterscheiden wäre nur, dass man das Meristem auch sofort auf festen Nährmedium mit Cytokeninen zum Sprossenwachstum anregen kann.
Man könnte auch mit der Gewebekultur anfangen und dann Meristeme entnehmen, dies würde dann die Desinfektion am Anfang einsparen, allerdings sind die im Glas gezogenen Pflanzen ja sehr klein und somit deren Meristemgewebe auch winzig.

Wieso überhaupt Meristeme?
Oft sind Pflanzen oder Mutterpflanzenstämme bei Gärtnern an Viren erkrankt und oft gibt es nur eine Pflanze zur Vermehrung, diese will man retten.

Wie?
Der Virus, der in die Pflanze eingedrungen ist kann ausgetrixt werden, jedoch geht dies nur in der Sterilkultur.
Hat man aus einem Meristem oder einer Gewebekultur eine neue Pflanze erzeugt, wird diese separat auf einen künstlichen Nährboden kultiviert und bei sehr hohen Temperaturen und mit Cytokeninen zum schnellwachstum angeregt.
Der Virus kann jedoch nicht so schnell nach kommen und die einzelnen Zellen bis zum Meristem in die Sprossspitze gelangen.
Sodann explantiert man dann dieses schnellgewachsene Meristem und überträgt es wieder in eine neue Sterilkultur, die nun daraus wachsenden Pflanzen sind virusfrei.

Die Zellkultur von Pflanzen hat zudem noch andere Möglichkeiten, aber erst einmal genug dazu.

Sicher versteht Ihr jetzt, wieso dies dann doch sehr aufwendig ist.
Allerdings ist es nicht ausgeschlossen, diese Variante der Vermehrung in jeder normalen Küche durchzuführen.
Als ich früher mit der Orchideenaussaat angefangen habe, welche ebenfalls auf speziellen Nährböden steril vollzogen wird, habe ich mit aufsteigendem Wasserdampf gearbeitet, denn das aufsteigende Wasser in Form von Wasserdampf ist in der Basis ebenfalls steril.

Jedoch müssen eben passende Nährmedien vorhanden sein und die Sache mit den Arbeitsgeräten muss steril erfolgen.


Zu den Geräten und Zubehör:

Ich benutze folgende Utensilien;

- sterile Werkbank
- einen Autoklaven
- Laborschüttler
- Mikroskop
- spezielle Lichanlagen
- einen Kulturschrank zur Einlagerung von Steril-Stammkulturen
- Erlenmeyerkolben in 100 ml, 250 ml, 500 ml
- Reagenzgläser
- Schraubverschlussgläser
- Samendesinfektionsfritte
- verschiedene Mikro- und Makrosubstanzen
- Phytohormone
- Agar zur Verfestigung der Nährmedien
- verschiedene Skalpelle
- Präzisionsscheren
- versch. Pinzetten
- Einweghandschuhe
- Natriumchloridlösungen in verschiedenen Konzentrationen
(zur Desinfektion von Orchideensamen und Pflanzenteilen)
- Labornadeln
- Laborwatte
- Verschlussfolie
- Bunsenbrenner
- Magnetrührer
- Bechergläser

__________________________

Würde man zu Hause arbeiten würde die Grundausstattung die folgende sein:

- Schraubverschlussgläser
- Sagrotanspray
- Natriumhypochloridlösung
- herkömmliche Kosmetikwatte
- Einweghandschuhe oder Putzhandschuhe
- Frischhaltefolie
- ein großer, breiter Kochtopf
- Backgitter oder anderes Gitter
- eine lange Pinzette mit feiner Spitze
- ein feines Skalpell oder Präzisionsmesser
- Bunsenbrenner / gibt es in klein

... und eben die passenen Nährsubstanzen, allerdings kommt es oft vor, dass man je nach Substans nur wenig benötigt, z.B. nur 0,001 Gramm oder so.
Destilliertes Wasser zur Anmischung.

Sollte man sich alle Nährsubstanzen anschaffen wäre man verrückt im Hobbybedarf, da dies zu kostenspielig wäre, man kann aber Rezepturen in der Apotheke mischen lassen, aber auch teuer.
Man kann fertige Nährmedien auch heute schon beziehen. *AUGENZWINKER*

Und als ich damit angefangen bin, hab ich noch im Backofen oder im Einkocher die Gläser mit Medium sterilisiert.
Geht also auch.

________________________________________

Wie lange dauert es bis zur Pflanze???

Je nach Pflanze von wenigen Wochen bis zu einigen oder mehreren Monaten.

________________________________________

Pflanzen sind groß genug und müssen aus den Kulturgefäßen, aber was nun???

Die Pflanzen kommen aus dem Glas und werden von dem gelartigen Nährboden befreit und abgespült.
Nun gehts in geeignete Kultursubstrate und es muss für eine hohe Luftfeuchtigkeit gesorgt werden, da sie sich erst an die Außenbeschaffenheiten der luft gewöhnen müssen. Würde man sie z.B. ohne Folie aufstellen, würden sie in sich eintrocknen, da das Gewebe noch weich und dünn ist.

Meist dauert die Eingewöhnung ca. 14 Tage bis 6 Wochen.

________________________________________

Hier noch mal ein paar Vorteile dazu:

- schnelle Erzeugung erbgleicher und identisch wachsender Jungpflanzen
- schnelle Möglichkeit neue Sorten im großen Stil auf den Markt zu bringen
- viruserkrankte Pflanzenstämme wieder zu gesunden Pflanzen regenerieren
- neue Sortenzüchtung im Reagenzglas mit Genveränderung, durch Zugabe verschiedenster Stoffe oder
Genaustausch ( allerdings halte ich dies ehr als Nachteil, meiner Meinung nach )
- Arterhaltung von aussterbenden Pflanzen
- Pflanzen auf Abruf poduzierbar, mit Hilfe der Stammkultureinlagerung
- zudem Jngpflanzen erzeugen, die im Grunde das selbe Alter der Mutter haben (zieht man Orchideen zum Beispiel aus Samen dauert es zwischen 2 bis 15 Jahre bis zur ersten Blüte, bei Klonen jedoch kann man nach einer
Kulturzeit von ca. 2 Jahren schon blühfähige Pflanzen erzeugen
- schneller Aufbau von Mutterpflanzen zur Stecklingsvermehrung

(...nur um ein paar genannt zu haben.)

Hier nun einige Bilder!

(...stelle ich hier morgen rein!)
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 2. Nov 2011, 22:31

Hier dann noch einmal die besagten Bilder!

... hier einmal die grobe Einrichtung vom Labor:

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...hier die sterile Werkbank:

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...hier wird gerade Nährboden hergestellt:

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...hier nun ein Ablauf in der Werkbank, wo schon eine Sterilkulturpflanze zerschnitten wird um diese wieder zu vermehren:

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...hier wird gerade ein Stück Zellgewebe (Kallus) abgetrennt und in flüssige Nährlösung gegeben:

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...diese Stücke kommen dann auf das Rotationsgerät (Schüttler):

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...zerschnittene Pflanzenteile kommen direkt auf feste Nährmedien:

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...nach ca. 2 Wochen sieht man dann die ersten Wurzeln:

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...aus den Kallusgewebestücken sind nun große Klumpen gewachsen und auf feste Nährmedien umgebettet worden, man sieht auch schon die Bildung von kleinen Pflänzchen:

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...diese werden abgetrennt und wieder umgesetzt:

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...diese dürfen dann wachsen:

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...sind sie groß genug, dürfen sie das Glas verlassen und wachsen zu einer richtigen Pflanze heran:

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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 2. Nov 2011, 22:39

Bis zur fertigen Pflanze hat es 2,5 Monate gedauert.
Je nach Pflanze unterschiedlich... kann auch mal 1 bis 2 Jahre vergehen.
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 2. Nov 2011, 22:51

Gern Wolke, hatte diesen Text auch drüben mal veröffentlicht...
Aber Gott brauchst nicht sagen, Sven reicht aus! :biggrinn:
Pflanzen sind mein Leben, kann ich anders wieder einmal nicht sagen. :peace_man:
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Farnese » 2. Nov 2011, 23:03

Ich werd verrückt. Ein einziger Fred ist hier ein ganzes Lexikon. Und sooooooooooo tolle Bilder. Wahnsinn. Dieses Labor und die Betriebswiese, da steckt ja ein Vermögen drin. Von der investierten Zeit und Liebe gar nicht zu reden!

Allergrößten Respekt.
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 2. Nov 2011, 23:06

Farnese, dit fing bei mir mit 14 Jahren so in etwa an...
Ist alles aus einem Hobby entstanden, hab früher noch Orchideen vermehrt. Daraus hat sich eben dit kleine Labor entwickelt. :greensmilies165:
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Hauke » 2. Feb 2014, 20:28

Hallo,

ich beschäftige mich eigentlich eher mit Pilzen und versuche gerade Ektomykorrizapilze zu isolieren und bin durchs googeln zu diesem interessanten Forum gekommen. Mit Zellkulturen möchte ich aber zukünftig auch arbeiten und habe bereits Phytohormone, Ms-Medium und woody-plant-medium vorätig, möglicherweise kann man ja sogar Mykorrhiza und Pflanze gleichzeitig vermehren..

Bisher habe ich die mykorrizierten Wurzelspitzen mit für ca. 10 sec in 20 % H2O2 sterilisiert und anschließend in Auqua dest gewaschen bevor sie auf Nährböden kommen.

Alternativ zu H2O2 möchte ich die Oberflächensterilisation auch mal mit Natruimhypochlorid versuchen, für Blattoberflächen werden in der Biologie üblicherweise erst 70 - 96% ETOH und dan 0,5 % Natriumhypochlorid verwendet um endophytische Pilze zu isolieren.

Die Suchfunktion bringt mich in diesem Forum leider nicht weiter, da immer die Meldung kommt zu viele Treffer - Schade..

Mich würde interessieren welches Protokoll (Konzentration + Einwirkzeit) Ihr genau verwendet und welche Bezugsquelle für Natriumhypochlorid empfehlenswert ist. Der einzige Laborbedarf den ich gefunden habe möchte 15 € für den Versand :-( aber vielleicht reicht ja auch Natriumhypochlorid für andere Anwendungen Pool etc. ?

Gruß Hauke
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon roswitha » 2. Feb 2014, 22:22

Hauke, Svenson kann da sicher weiterhelfen. :greensmilies165:
Liebe Grüße roswitha
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 3. Feb 2014, 09:30

Hallo Hauke,
leider kenne ich mich nicht gut in der Isolation von pilzen aus, hab zwar da auch mal was gemacht aber schon ne Weile her.
Ich habe mal Kulturpilze gezogen und dafür Impfplatten angelegt.

Du kannst normale Natriumhypochlorit verwenden, wie es auch beim Poolbedarf gibt, eine billigere Varianta wäre Danklorix (blaue Flasche).
Wird als Desinfektionsreiniger verkauft.

Anwendung für eine 0,5 %ige Lösung wäre folgende:
9 ml DanKlorix und 41 ml destilliertes Wasser somit hast Du dann 50 ml 0,5%ige Bleichlösung.

Ist wirklich die kostengünstigste Variante. :greensmilies165: :good:
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 3. Feb 2014, 09:36

Sag mal Hauke, was genau für Pilze hast Du denn und wozu nutzt Du diese?
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Hauke » 5. Feb 2014, 02:51

Hallo Svenson,
erstmal Danke für den Tip, habe mir Danklorix gekauft.

Bisher habe ich mich mit Kultur- und Medizinalpilzen beschäftigt und habe eine recht große Sammlung von ca. 50 Arten und hiervon diverse Zucht- und Wildstämme. Ich möchte mich gerne in diesem Bereich Selbstständig machen und arbeite daran einige Pilze zu kultivieren für die noch eine Marktnische besteht, wie z.B. Morcheln.

Momentan Versuche ich Trüffel (verschiedene Arten) zu isolieren um hiermit (junge) Bäume beimpfen zu können. Es ist allerdings extrem schwierig Myzel aus Trüffel-Fruchtkörpern zu isolieren, was bei den meisten anderen Pilzen sehr einfach ist, außerdem weiß ich nicht wie das Myzel dann aussehen sollte. Also sammle ich momentan verschiedene Morphotypen, die ich isoliert habe, um diese dann dann später sequenzieren (ITS) zu lassen.

Aktuell arbeite ich gerade mit frischem mykorrhiziertem Wurzelmaterial, da hier weniger Fremdpilze auftreten sollten. Vielleicht ist es möglich mit der von dir beschriebenen Methode Pilz und Pflanze gleichzeitig zu vermehren ? - es handelt sich ja um Wurzelspitzen, also mit Meristem, dessen Interzellularräume mit Trüffelmyzel durchsetzt sein müsste..

Das Protokoll das für Endophytische Pilze verwendet wird:
- erst waschen mit 0,01 % Tween
- dann 1 min 75 % EtOH
- dann 3 min 0,5 % NAClO
- dann 30 sec 75 EtOH um das NaCLO wieder zu entfernen und anschließend unter sterilen Bedingungen trocknen lassen.

Welches Protokoll verwendes du zur Oberflächensterilisierung von Pflanzenmaterial?

Es gibt aber auch Ektomykorrhizapilze wie z.B. Pisolithus tinctorus, die weitestgehend unspezifisch Symbiosen mit Pflanzen eingehen und förderlich für das Wachstum der Pflanzen sind. Auch für Orchideen und somit für dich sind Mykorrhizapilze ja von Bedeutung (http://www.ewetel.net/~frank.meissner2/ ... 987670.htm), die Seite kennst du sicher..
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 6. Feb 2014, 08:11

Ja die Seite kenne ich.
Auch Dein Protokoll zur Vorbehandlung der Isolation.
Habe es so auch mit Trüffel gemacht. Ja,ja Trüffel hab ich auch... :greensmilies165:

Für verschiedene Gewebeisolationen habe ich auch verschiedene Desinfektionsverfahren.
Ich arbeite viel mit Danklorix und mache es ähnlich wie bei dem von Dir genannten Protokoll.
Allerdings ist es wirklich sehr abweichend von Pflanze zu Pflanze und je nach Blattstruktur.
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Hauke » 7. Feb 2014, 18:33

Das wäre ja super :good: , aber so richtig sicher kann man sich eigentlich erst sein, wenn man die Isolate sequenziert hat, oder damit Bäumchen mykorrhiziert hat - wobei du ja schon sehr professionell arbeitest.

Welches Medium hast du zur Isolation verwendet, bzw. hast du Cytokinin zugestzt? Ich hatte bei meinem ersten Versuch eine Cytokinin Stammlösung herzustellen Schwierigkeiten mit der Löslichkeit unter Verwendung von 70 % EtoH, habe mir jetzt aber 96% igen besorgt, muss zusätzlich noch erwärmt werden?

Welche Tuber-Art hast du den isoliert? Wenn möglich würde ich dein Isolat gerne testen lassen bzw. abkaufen (zum Tauschen habe ich glaube ich nichts anzubieten).

Gruß Hauke
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 8. Feb 2014, 09:00

Hauke sei nicht böse. Aber Sterilkulturen von besonderen Pflanzen oder in diesem Fall von Pilzisolationen verlassen unser Haus nicht.

Wir kultivieren ab Mai ebenfalls Trüffelbäume.

Cytokinine gibt es einige... Wozu soll es dazu?

Isolation klappt auch gut mit Haferflocken-Kartoffelagar.
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Hauke » 8. Feb 2014, 15:37

Hallo Svenson,

das kann ich gut verstehen, es handelt sich dabei ja auch um eine wertvolle Kultur, die schwer zu isolieren ist, insbesondere wenn Ihr auch Trüffelbäume herstellt. Trotzdem Danke für deine Antworten und Glückwunsch - da du ja offenbar bereits mykorrhizierte Bäume hast.

Es gibt ein Paper, in dem ein positiver Zusammenhang einer geringen Cytokininkonzentration und dem Wachstum von Tuber sp. in Reinkultur festgestellt wurde, mein Gedanke war, dass wenn das Pflanzenmaterial weiterwächst auch der Pilz positiv beeinflusst wird und leichter zu isolieren ist. Aber sicher hast du Recht und es ist überflüssig.
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Re: Die In-Vitro-Gewebe- / Zellkultur!

Beitragvon Svenson » 10. Feb 2014, 09:44

Unsere ersten Trüffelbäume gehen ab 2015 in den Verkauf, eventuell schon Herbst 2014.
Mal sehen.

Aber Cytokinin brauchst Du dafür im Grunde wirklich nicht. Zumindest nach meinem Wissen nicht.
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